Транспозоны на службе у человека

Ретротранспозоны (или ретроэлементы) — более молодой класс МГЭ, которые до сих пор проявляют свою активность в геномах многих организмов. В том числе — и у человека, в геноме которого они составляют подавляющее большинство мобильных элементов, более 40%.

Для своего перемещения ретротранспозоны используют механизм обратной транскрипции. На что указывает приставка «ретро-» в их названии. Сам процесс обратной транскрипции был открыт в 1970 году двумя Нобелевскими лауреатами, американскими учеными Говардом Темином и Дэвидом Балтимором. В ходе него образование ДНК происходит на основании информации из РНК, которая здесь выступает матрицей. Кроме ретроэлементов, этот механизм для своего размножения используют и ретровирусы. Характерно, что фермент обратная транскриптаза задействована как в перемещении ретротранспозонов, так и в теломерах (теломеразе). У дрозофил, единственный пока описанный уникальный случай, когда роль теломеразы напрямую исполняют ретротранспозоны [2].

ДНК-транспозоны — более древние. И из-за накопившихся мутаций уже утратили свою активность в геномах млекопитающих (за редкими исключениями, такими, как летучие мыши). Для своего перемещения они используют механизм, который получил название «cut and paste» (вырезать и вставить). Что удивительно и важно для нашего обзора, в геномике сегодня используется в основном не активные «молодые» ретроэлементы, а более «древние» неактивные ДНК-транспозоны. И связано это как минимум с двумя причинами. Во-первых, ДНК-транспозоны не делают своих копий, а действительно перемещаются по геному, имея в своем арсенале фермент, специально «заточенный» для таких перемещений. И при своих передвижениях ДНК-транспозоны, такие, как используемые генетиками транспозоны Tc1/mariner, не зависят от факторов организма «хозяина», действуя автономно. Полагаясь, так сказать, на свои силы. В том числе не зависят и от энергии в виде АТФ. Потому что энергия, необходимая для их интеграции, поступает в ходе реакции расщепления целевой ДНК. Что позволяет ученым использовать эти элементы в генетических манипуляциях, оживляя древние реликты из нескольких копий.

Как же происходит перемещение ДНК-транспозонов?

Удивительно, но фермент транспозаза, при помощи которого и происходит перемещение транспозона, оказался универсальным средством для создания иммунной системы живых организмов. Причем как у позвоночных, так и у бактерий. У позвоночных транспозаза древних транспозонов Тransib около 500 млн. лет назад стала основой для появления белков RAG, необходимых для иммунного механизма V(D)J-рекомбинации. Это открытие было также сделано упоминавшимся выше В. Капитоновым. У бактерий же древняя транспозаза транспозона, названного каспозон, стала основой для знаменитой сегодня системы иммунитета прокариот CRISPR-Cas. Что обнаружил ещё один известный российский ученый-вирусолог Евгений Кунин с коллегами.

Кунин тоже особо отметил факт участия транспозонов в создании иммунитета живых организмов: «Вероятный вклад каспозонов в эволюцию CRISPR-Cas параллелен участию транспозазы RAG1 в перестройке гена иммуноглобулина позвоночных. И это показывает, что привлечение эндонуклеаз мобильных элементов в качестве готовых инструментов для манипуляции геномом является общим путем эволюции адаптивного иммунитета». Позже Е.Кунин с коллегами описали ещё несколько заимствований у транспозонов, благодаря которым окончательно сформировалась система иммунитета у прокариот. А также одно обратное заимствование, о котором мы расскажем чуть позже [5,6].

И вот теперь генетики поставили транспозоны на службу в геномике.

Примечательно, что для мобильных элементов описаны случаи не только вертикального наследования, от родителей к потомству, но и горизонтального переноса между разными особями и даже разными видами. Горизонтальный перенос позволяет транспозонам продолжить свой жизненный цикл и не исчезнуть совсем в результате мутаций с течением времени. Так как их транспозиция не требуют определенных факторов от организма «хозяина», у них не должно быть проблем с приживаемостью в новом месте. Был описан ряд случаев горизонтального переноса различных МГЭ между морскими животными насекомыми из разных отрядов, а также между организмами из разных видов, такими, как человек и нематода [7–10].

Пока не до конца понятно, как мобильные элементы могут проникать в новые геномы. Потенциальными переносчиками, которые могут участвовать в горизонтальном переносе, выступают внешние паразиты, такие как клещи и вирусы [11,12].

Ещё один возможный механизм горизонтального переноса ретротранспозонов открыли в 2007 году российские биологи из МГУ, Л. Нефедова и А. Ким. Они описали, как один из ретротранспозонов в геноме дрозофилы D. melanogaster приобрел характерный вирусный ген env. После чего превратился в ретровирус и смог перемещаться горизонтально, от дрозофилы к её эндосимбионту (микроорганизму, живущему внутри дрозофилы) — бактерии Wolbachia pipientis [13].

В 2015 году Z. Tang с коллегами обнаружили факты горизонтального переноса ДНК-транспозонов между насекомыми, пресноводными планариями (червями) и летучими мышами [14].

И совсем недавно, в 2019 году японские ученые описали еще один возможный способ горизонтального переноса ретротранспозонов LINE-1 [15].

В 2020 году китайские и французские биологи в своей работе проанализировали 307 геномов позвоночных и обнаружили несколько сотен независимых событий горизонтального переноса между эволюционными линиями, которые разошлись в ходе эволюции более 120 миллионов лет назад [16].

Как мы уже говорили выше, уникальные свойства транспозонов, связанные с их перемещением и автономностью, обратили на себя внимание генетиков. Которые с начала 2000-х годов взяли их на вооружение в своих экспериментах и исследованиях.

В каком качестве транспозоны могут применяться в генетических исследованиях?

Во-первых, их можно использовать в таком научном направлении, как функциональная геномика, занимающаяся изучением функций генов. Все то огромное количество генов в геноме и еще более огромное количество продуктов, которые они синтезируют, требует описания их функции. Говоря научным языком — решения проблемы функциональной аннотации каждого гена и разработки генетических сетей и путей. Для этого ученые разными методами проводят генетический функциональный скрининг для создания мутантных фенотипов путем инсерционного мутагенеза. Звучит немного сложно. Но в сущности это внедрение в геном чужеродной ДНК для изменения активности генов (повышения или понижения активности), с целью проанализировать последующие за этим изменения. Так, вставка транспозона в открытую рамку считывания (ORF) вызывает мутацию с потерей функции.

В другом варианте, вставка транспозона, несущего сильный промотор, может напротив, активировать экспрессию. И последующее выявление фенотипов, связанных с мутационным изменением активности определенных генов, позволяет описывать их функции.

Даже из этого короткого описания можно увидеть, насколько это непростая (прямо скажем — сложная) работа. И транспозоны её сильно облегчают.
Мутация генов посредством вставки отдельных частей чужеродной ДНК имеет, по мнению генетиков, по крайней мере два преимущества перед другими стратегиями мутагенеза.

Во-первых, вставка чужеродной ДНК обычно связана с более сильной мутагенной нагрузкой, чем точечная мутация, тем самым генерируя более устойчивые фенотипы.

Во-вторых, вставленный фрагмент ДНК может служить уникальной молекулярной меткой, которая позволяет быстро методом ПЦР идентифицировать мутировавший аллель [17].

Этот подход, кроме всего прочего, имеет немалую ценность в экспериментах с целью идентификации генов, связанных с онкогенезом. Которые успешно проводятся на животных моделях с применением транспозонов Sleeping Beauty и PiggyBac. Причем на этот подход ученых навели полученные ещё в конце прошлого века данные об участии ретровирусов в онкогенезе, посредством вызываемого ими инсерционного мутагенеза. Когда интеграция провируса вызывает специфические генетические повреждения и активацию эндогенных онкогенов [18,19].

Ещё одно важное направление, связанное с транспозонами и мутагенезом — это изучение генома патогенных бактерий. Для того, чтобы выявлять гены, связанные с их инфекционностью и эффективнее воздействовать на патоген. Такой, к примеру, как известная бактерия H. Pylori. Или исследование генома посредством транспозонного мутагенеза полезных бактерий, таких, как цианобактерии. Которые активно изучаются для применения в химической и фармацевтической промышленности [20,21].

Ещё одно направление использования транспозонов в геномике — это трансгенез (то есть искусственное введение в организм чужеродного гена, трансгена). И тут для использования транспозонов открывается довольно широкое поле для применения. Первыми здесь нашли свое применение вирусные векторы. Но, как уже известно, у использования вирусных векторов имеются некоторые ограничения. Связанные с их иммуногенностью и малой грузоподъёмностью, что препятствует переносу более крупных генов. Также производство вирусных векторов — дело дорогостоящее и требует больших материальных затрат. Что и послужило причиной в качестве замены им рассматривать альтернативные методы. И транспозоны тут как раз пришлись очень кстати.

Этот подход, кроме всего прочего, имеет немалую ценность в экспериментах с целью идентификации генов, связанных с онкогенезом. Которые успешно проводятся на животных моделях с применением транспозонов Sleeping Beauty и PiggyBac. Причем на этот подход ученых навели полученные ещё в конце прошлого века данные об участии ретровирусов в онкогенезе, посредством вызываемого ими инсерционного мутагенеза. Когда интеграция провируса вызывает специфические генетические повреждения и активацию эндогенных онкогенов [18,19].

Ещё одно важное направление, связанное с транспозонами и мутагенезом — это изучение генома патогенных бактерий. Для того, чтобы выявлять гены, связанные с их инфекционностью и эффективнее воздействовать на патоген. Такой, к примеру, как известная бактерия H. Pylori. Или исследование генома посредством транспозонного мутагенеза полезных бактерий, таких, как цианобактерии. Которые активно изучаются для применения в химической и фармацевтической промышленности [20,21].

Ещё одно направление использования транспозонов в геномике — это трансгенез (то есть искусственное введение в организм чужеродного гена, трансгена). И тут для использования транспозонов открывается довольно широкое поле для применения. Первыми здесь нашли свое применение вирусные векторы. Но, как уже известно, у использования вирусных векторов имеются некоторые ограничения. Связанные с их иммуногенностью и малой грузоподъёмностью, что препятствует переносу более крупных генов. Также производство вирусных векторов — дело дорогостоящее и требует больших материальных затрат. Что и послужило причиной в качестве замены им рассматривать альтернативные методы. И транспозоны тут как раз пришлись очень кстати.

Первое, что выгодно отличало эти элементы — их хорошая грузоподъёмность. Для трансгенеза в генной инженерии необходимо переносить немало всего. Трансгенные конструкции включают в себя кодирующие области генов со всеми необходимыми элементами регуляции транскрипции. И могут составлять несколько тысяч пар оснований (т.п.о). Транспозоны, такие как PiggyBac, Tol2 и Sleeping Beauty, как раз и могут переносить трансгенные грузы большого размера.

Долгое время считалось, что соматические клетки, дифференцированные (то есть получившие специализацию) в ходе эмбрионального развития организма невозможно вернуть в первоначальное стволовое состояние. К концу прошлого века уже было известно несколько транскрипционных факторов, необходимых для поддержания состояния плюрипотентности (то есть возможности дифференцироваться в любые типы клеток): это Oct3/4, Sox2 и Nanog. Позже к ним добавились и другие факторы. Ставший впоследствии знаменитым Нобелевский лауреат Шинья Яманака со своей командой протестировал 24 из известных в то время транскрипционных фактора. Как показали результаты его исследования 2006 года, для получения из мышиных фибробластов ИПСК достаточно было ввести в их геном всего 4 фактора: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. В 2007 году тоже самое им удалось проделать и с человеческими фибробластами [35].

Что же это за чудо-факторы?

Сегодня ИПСК (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) активно изучают во многих лабораториях. Есть несколько потенциальных направлений, связанных с клиническим применением ИСПК. Зная их способность превращаться в любые типы клеток, сразу напрашивается на применение заместительная клеточная терапия с использованием ИПСК при патологиях, связанных с потерей клеток. Как к примеру, при нейродегенерации. Также их можно применять при тестировании новых лекарственных средств и создании клеточных моделей заболеваний человека. Как это уже сделано, к примеру, с клеточной моделью болезни Паркинсона [38].

Кроме всего прочего, ИПСК могут нам помочь в борьбе со старением. Так, в 2019 году американские биологи из университета Джона Хопкинса описали, что внеклеточные везикулы, секретируемые ИПСК содержат важные антиоксидантные ферменты, пероксиредоксины. Эксперименты на клеточных культурах показали их возможное потенциальное применение в борьбе со старением клеток. Причем, как показало сравнение количества внеклеточных везикул из ИПСК и другого вида популярных стволовых клеток, мезенхимальных (МСК), ИПСК секретировали везикул в 16 раз больше, чем МСК. И это открытие может иметь немалую ценность. Так как предыдущие исследования показали, что везикулы, продуцируемые и секретируемые МСК человека, могут заменять сами МСК в терапии по восстановлению и регенерации тканей [39].

Но, вернемся к нашим транспозонам. В первоначальных работах Ш. Яманака и другие исследователи использовали для введения в геном индуцирующих плюрипотентность факторов ретровирусные и лентивирусные векторы. Как альтернатива вирусным векторам в последние годы стала развиваться невирусная доставка генов при получении ИПСК посредством ДНК-транспозонов.

Как показали исследования, транспозоны могут быть эффективными инструментами для клеточного репрограммирования нескольких типов клеток при получении ИПСК.

Системы переноса на основе элементов piggyBac и Sleeping Beauty использовались для генерации ИПСК как в клетках человека, так и различных животных. Таких, как мыши, крысы, свиньи лошади летучие мыши, обезьяны и др. Производство ИПСК из клеток животных очень важно для создания моделей болезней и производства некоторых веществ для применения в медицине. Таких, как ферменты и гормоны роста, которые нужны людям, страдающим определенными генетическими заболеваниями [40].

При этом клеточное репрограммирование с помощью транспозонных систем позволяет в последующем удалять трансген и получать «свободные от трансгена» ИПСК. Что важно для уменьшения риска реактивации факторов репрограммирования. Которые, как мы помним из их описания, все имеют онкогенный потенциал.

Но это ещё не всё. Кроме получения ИПСК, транспозонные системы показали свой потенциал перепрограммировании и других видов стволовых клеток. Тут надо отметить, что со стволовыми клетками сегодня связаны немалые надежды в лечении различных заболеваний. После генетической манипуляции на основе транспозонов по введению нужного гена, стволовые клетки могут быть размножены in vitro (вне организма, в клеточной культуре) и затем подвергнуты дифференцировке в определенные клеточные линии в соответствии с конкретной терапевтической надобностью. Сегодня уже имеются данные, показывающие надежный, вызванный транспозоном перенос генов в нескольких клинически значимых типах стволовых клеток. Таких, как эмбриональные стволовые клетки, CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), МСК и миобласты [41].

И что важно, инструменты на основе транспозонов имеют перспективы по коррекции генов в стволовых клетках из-за их большей безопасности, по сравнению с вирусными методами. Которые в клинических испытаниях приводили к серьезным побочным реакциям, таким, как инсерционный онкогенез [42].

Так, к примеру, в одном из исследований транспозон-опосредованный перенос генов интерферона IFNγ в МСК использовали в модели меланомы на мышах. И было показано, что экспрессирующие IFNγ МСК, вживленные в строму опухоли, ингибируют рост опухоли и ангиогенез, а также улучшают выживаемость мышей [43].

Вирусные векторы сейчас широко используются в производстве CAR Т-клеток. Но этот метод производства имеет свои существенные недостатки. Во-первых, возможность онкогенного и мутагенного потенциала требует более стабильного вектора, который в конечном итоге будет использоваться для получения CAR Т-клеток клинического уровня. Во-вторых, использование вирусов в лабораториях связано с рядом строгих правил. В-третьих, лентивирусная и ретровирусная трансдукция ограничена малой грузоподъёмностью транспортируемой ДНК, о чем мы уже говорили выше. И в целом стоимость производства вирусных векторов гораздо выше, чем стоимость их аналогов на основе транспозонов. И потому невирусные методы переноса генов могут быть более приемлемыми для производства клинического уровня.

Поэтому для применения транспозонов здесь открывается широкая дорога. И они уверенно по ней «зашагали» своими воображаемыми ногами.

Так, система на основе транспозона Sleeping Beauty. в настоящее время используется в качестве замены вирусным векторам при получении, например, CD19 + CAR Т-клеток с противоопухолевой активностью как in vitro, так и in vivo [45].

Основным преимуществом этого метода выступает более качественная интеграция трансдуцированного генетического материала. Что достигается за счет более низкой промоторной активности интегрированного транспозона. Системы Sleeping Beauty. также вызывают гораздо меньше эпигеномных изменений в непосредственной близости от сайта интеграции [46].

В 2019 году Z. Ivics с коллегами разработали новый модифицированный вариант транспозазы Sleeping Beauty. Он имеет несколько улучшенных характеристик, в том числе повышенную стабильность и способность проникать в клетки. Вот как об этом пишут авторы: « Одним из наиболее явных преимуществ новой технологии является то, что она позволяет производить транспозазу в промышленных масштабах в фармацевтических целях. Что делает систему доставки генов Sleeping Beauty еще более привлекательной для будущих терапевтических применений. На данный момент наша новая процедура клеточной инженерии дешевле в исполнении и приведет к снижению затрат. А за счет повышения точности и контроля метода — к повышению безопасности модификаций генома, значимых с медицинской точки зрения» [47].

Система транспозонов PiggyBac также может применяться для производства CAR Т-клеток. И были успешно опробованы для генерации различных CAR Т-клеток [48-50].

Сегодня уже имеется несколько клинических испытаний по терапевтическому применению CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов [51-54].

В 2021 году к КИ по применению CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов, подключился и создатель Sleeping Beauty Z. Ivics со своей командой. В одном из журналов Nature вышел отчет его команды о первом клиническом испытании по применению SLAMF7 CAR-T-клеток. Они были получены безвирусным переносом посредством системы Sleeping Beauty для лечения множественной миеломы. Все это происходит в рамках созданного проекта CARAMBA. Консорциум CARAMBA состоит из десяти партнеров из шести стран ЕС. В него входят четыре передовых клинических центра в области клинической помощи и исследований миеломы: Университетская клиника Вюрцбурга (Германия), больница Сан-Рафаэле (Италия), университет Наварры (Испания) и Региональный госпитальный центр и университет Лилля (Франция). Среди других партнеров проекта — институт Пауля Эрлиха (Федеральный институт вакцин и биомедицинских препаратов, Германия), биотехнологические компании NBE-Therapeutics (Швейцария), и T-CURX (Германия). А также французский провайдер управления проектами ARTTIC SAS. Европейская комиссия выбрала проект CARAMBA из большого числа высококонкурентных проектных предложений в рамках конкурса «Инновационные методы лечения редких заболеваний» в программе исследований и инноваций Horizon 2020 [55].

Ну и напоследок — «изюминка» в исследованиях транспозонов. Самые последние разработки по совместному применению транспозонов с системой CRISPR-Cas.

Вначале мы уже рассказывали об открытии Е.Кунина, показавшего происхождение системы прокариотического (то есть у архей и бактерий) иммунитета CRISPR-Cas от транспозонов. Но на этом дело не закончилось. Неутомимый Е.Кунин с коллегами через несколько лет после своего первого открытия описали ещё один примечательный факт. Как оказалось, эволюция в своем неспешном движении может пройти полный круг: дав вначале основу для возникновения иммунной системы у прокариот, другие транспозоны впоследствии приобрели систему CRISPR-Cas для лучшей своей интеграции в геномы [56].

Поначалу факт наличия у транспозонов иммунной системы CRISPR-Cas вызывал у исследователей недоумение. Зачем геномным «паразитам» средство защиты от паразитов? От кого им защищаться? В итоге выяснилось, что они приспособили этот механизм для лучшего проникновения в геномы. В 2019 году американские ученые подробно описали интеграцию транспозонов посредством адаптированной CRISPR-Cas. Федор Урнов (из Института инновационной геномики, Беркли, Калифорния) в своей статье в Nature довольно образно сравнил такой поворот в эволюции транспозонов с гамлетовской историей: «Когда Гамлет смертельно ранен отравленным клинком Лаэрта в их поединке, он берет оружие противника и наносит ответный удар. Убивая Лаэрта его собственным мечом. S. Klompe с коллегами описывают столь же драматическую смену оружия в биологической войне. Они показали, что молекулярная машина под названием Cascade (один из вариантов CRISPR-Cas), которую бактерии используют для защиты от генетических захватчиков, также может быть использована против них некоторыми из этих захватчиков» [57,58].

Понятно, что мимо такого факта не могли пройти исследователи, занимающиеся генной инженерией. Объединить транспозоны с CRISPR-Cas для более совершенного редактирования генома — такая идея напрашивалась сама собой. И вскоре она была уже реализована. В том числе и командой Евгения Кунина. Примечательно, что ещё начиная с 2014 года, предвосхитив будущие открытия, две группы исследователей создали систему для редактирования ИПСК, объединив нуклеазу Cas9 с транспозоном piggyBac. В результате чего удавалось не только эффективно переносить трансген, но и бесследно удалять его, когда это было необходимо [59-63].

Биотех компании, разрабатывающие терапий на основе CAR Т-клеток, произведенных с помощью транспозонов