научный обзор

SENS-Диагностика.
Биомаркеры белковых агрегатов

      Денис Одиноков, Алексей Ржешевский
      3 сентября 2018
      Часть 2
      SENS-Диагностика. Биомаркеры внутриклеточного «мусора»
      Продолжение серии научных обзоров SENS-диагностики. В этот раз внимание уделено биомаркерам внеклеточного "мусора".
      Часть 4
      SENS-Диагностика. Биомаркеры гликирования белков
      Продолжение серии научных обзоров SENS-диагностики. В этот раз внимание уделено биомаркерам гликирования белков.
      Белки играют важнейшую роль во всех живых организмах, выполняя множество различных функций.

      Как известно, они состоят из аминокислот. Но для того, чтобы выполнять свои функции, белки должны быть не просто цепочкой из определённых аминокислот, но иметь определённую пространственную форму, то есть должным образом укладываться в пространстве.

      По разным причинам в нормальной укладке белка в нужную структуру может происходить сбой. Тогда появляются неправильно свёрнутые белки, которые имеют свойство объединяться в скопления, агрегаты белков — амилоидные фибриллы. Самым известным из таких агрегатов является β-амилоид (Aβ, Abeta), предположительно связанный с развитием нейропатологий, а также некоторых видов рака и одной из причин деменции у лиц, страдающих синдромом Дауна.

      Такие белковые структуры имеют диаметр около 5–10 нм и длину до 800 нм, состоят из двух и более параллельных разнонаправленных филаментов, образующих специфическую структуру — кросс-бета-складчатую конформацию. Именно такая структура определяет специфическое оптическое свойство амилоида — способность к двойному лучепреломлению. Обнаружение этого свойства положено в основу диагностики амилоидоза: при микроскопии препаратов, окрашенных красителем «конго красный», в поляризованном свете амилоид изменяет красный цвет окраски на зеленое свечение [1].
      Скопления неправильных белков авторы концепции SENS называют «внеклеточным мусором» (Extracellular junk) и определяют как одна из причин старения, что видится вполне справедливым. Амилоидные фибриллы в силу своей структуры не подвержены действию специальных ферментов, расщепляющих белки (протеаз), и потому имеют свойство накапливаться в тканях организма, нарушая их работу.

      Структурные и химико-физические свойства амилоида зависят от основного белка-предшественника, содержание которого в фибрилле — около 80%, и это определяет специфичный признак для каждого типа амилоидоза.
      Термином амилоидоз обозначают группу наследственных или приобретенных заболеваний, связанных с внеклеточным отложением фибрилл нерастворимых белков, вызывающих тканевые структурные нарушения и дисфункции органов.

      В настоящее время известно более 20 амилоидогенных белков-предшественников и столько же клинических вариантов амилоидоза. Кроме широко известного β-амилоида существует АА-амилоид, связанный с ревматоидным артритом, болезнями сердца, почек и воспалением кишечника, AIAPP-амилоид, участвующий в патогенезе сахарного диабета 2 типа, и другие [2].
      Рисунок 1
      β-амилоид
      Способ решения проблемы накопления белковых агрегатов авторы SENS видят в использовании специализированных каталитически активных антител, так называемых абзимов (англ. abzyme, antibody enzyme), которые подбираются конкретно под амилоиды и удаляют их из ткани.

      Недавно в рамках этого подхода был разработан один перспективный способ. Было обнаружено подмножество человеческих антител, которое обладает каталитической активностью против определенного антигена, разбивая его на более мелкие и менее вредные фрагменты, а не захватывает его для удаления или разрушения другими иммунными клетками. Использование этих новых каталитических антител в качестве терапии для нацеливания на амилоиды дает потенциальные преимущества перед секвестрирующими антителами, применяемыми в других вакцинах, нацеленных на амилоиды.
      Первое заключается в том, что ожидается сокращение дозы, необходимой для эффективного удаления внеклеточных агрегатов из тканей. Это связано с тем, что секвестрирующие антитела могут захватить, а затем транспортировать только одну молекулу амилоида за один раз. Абзимы же связываются с молекулой амилоида, измельчают ее и затем переходят на следующую, одну за другой, позволяя каждой молекуле антитела быстро разрушать несколько амилоидных молекул.

      Другим является то, что каталитические антитела относятся к классу, который более эффективно переносится через гематоэнцефалический барьер, защищающий наш мозг, тогда как секвестрирующим антителам труднее преодолеть этот барьер [3].
      Самым известным и наиболее изученным сегодня амилоидом является β-амилоид, который многие исследователи связывают с болезнью Альцгеймера. Эта патология была описана больше века назад А. Альцгеймером, который первым указал на основной патоморфологический признак данного заболевания — нерастворимые сенильные бляшки, обнаруживаемые в мозге умерших, страдавших этой болезнью. Сегодня в мире насчитывается более 40 миллионов человек с диагнозом болезни Альцгеймера — вероятность развития данной патологии удваивается каждые пять лет после 65-летнего рубежа. Долгосрочные оценки ВОЗ, касающиеся массового увеличения таких больных в ближайшие десятилетия, крайне пессимистичны.
      Известно, что нерастворимые бляшки в мозге больных образованы главным образом β-амилоидным пептидом (Aβ), который имеет молекулярную массу 4 кДа и длину около 40 аминокислотных остатков. Aβ представляет собой фрагмент трансмембранного белка предшественника бета-амилоида (amyloid precursor protein, АРР), который обнаруживается во многих тканях организма, в том числе в синапсах нейронов. АРР вовлечен в некоторые физиологические процессы, связанные с нейропластичностью, образованием синапсов и нейропротекцией (выживанием нервных клеток) [4].

      В отличие от своего предшественника, Aβ является токсичным для нервных клеток, способствуя их дегенерации и гибели. Он образуется путём отделения внеклеточного N-концевого домена (sAPP) белка-предщественника. Этот процесс может быть осуществлён двумя разными секретазами, которые имеют принципиальное различие в своём действии: α-секретазой и β-секретазой.

      В первом случае фрагментация происходит между аминокислотными остатками внутри последовательности Аβ, что предотвращает последующее образование амилоидного пептида.
      Во втором, патологическом, под воздействием β-секретазы процесс фрагментации в силу своих особенностей заканчивается образованием Аβ. Этот путь — более редкий, и почему фрагментация белка-предшественника идёт по нему, остаётся не до конца ясным [5].

      Нейротоксичность Аβ связана с нарушением кальциевого гомеостаза, эксайтотоксичностью, воспалительными процессами, стимулированием окислительного стресса и апоптоза. Ранее господствовало мнение, что накопление в мозге Аβ — процесс сугубо патологический в силу невозможности выведения Аβ из тканей мозга. Сегодня известно, что Аβ всё-таки может выводиться из мозга как минимум 2 путями: периваскулярным (через лимфу) и протеолитическим (расщеплением различными ферментами) [6, 7].

      Поэтому формирование в пожилом возрасте болезни Альцгеймера с сопутствующим ей накоплением нерастворимых фибрилл амилоида может быть связано с разными стимулирующими факторами, которые могут иметь генетическую природу и быть связаны со стрессами, гипоксией, ишемией и перенесёнными инсультами [8].
      Рисунок 2
      β-секретаза
      β-амилоид окисляет холестерин и полиненасыщенные жирные кислоты, образуя наиболее токсичные активные формы кислорода — гидроксильный радикал и перекись водорода. Рацемизация L-аспарагиновой кислоты в долгоживущих белках способствует формированию β-амилоида и α-синуклеина. Патологические скопления последнего наблюдаются при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни Леви и других нейродегенеративных заболеваниях.
      Ещё одним патоморфологическим признаком нейродегенерации при болезни Альцгеймера являются агрегаты гиперфосфорилированного тау-белка (τ-белка): парные спиральные филаменты (PHF) и нейрофибриллярные клубки (NFT). Физиологически τ-белок участвует в стабилизации микротрубочек нейронов, которые обеспечивают перенос через цитоплазму нейронов клеточных органелл, гликопротеидов и других веществ. При болезни Альцгеймера τ-белок гиперфосфорилируется, теряет нормальную способность стабилизировать микротрубочки и скапливается в клетке нерастворимыми нейротоксичными структурами.
      Что во время формирования патологии происходит ранее — формирование агрегатов амилоида или τ-белка — вопрос не до конца ясный. Но, очевидно, что эти два процесса взаимосвязаны и стимулируют друг друга. Так, оба патологичных белка демонстрируют прионные свойства, схожие с прионным белком PrPsc: неправильно свёрнутые формы белков по типу цепной реакции стимулируют превращение нормальных белков в неправильные в окружающих их здоровых нейронах. Между собой Аβ и τ-белок также взаимодействуют по типу прионов: описано, как Аβ активирует протеинкиназу GSK3, фосфорилируя τ-белок и вызывая его неправильный фординг [5].
      Рисунок 3
      τ-белок
      Ещё совсем недавно считалось, что, хотя прионные болезни и болезнь Альцгеймера имеют определённые биохимические сходства, вторая патология, в отличие от первой, не является инфекционной и не передаётся от одного организма к другому. Но в 2015 году появились первые тревожные новости. В журнале Nature была опубликована статья британских неврологов, в которой было рассказано о возможном пути передачи Аβ от одного человека другому. Авторы провели аутопсийное исследование мозга восьми человек, умерших от болезни Крейтцфельдта-Якоба.

      У шести умерших, в дополнение к повреждениям, связанным с основной болезнью, в мозге обнаружили обширные скопления амилоидов, что нехарактерно ни для молодого возраста умерших, ни для данной патологии. В их геномах также не было найдено никаких дефектов, связанных с амилоидогенезом и нейропатологиями. Исследователи предположили, что Аβ были занесены в организм умерших во время инъекций заражённого амилоидом гормона роста точно также, как ранее были заражены и погибли несколько сотен людей от инъекций гормона роста, содержавших прионы [9].
      Рисунок 4
      Функции τ-белка в норме и патологии
      Подтверждением инфекционности болезни Альцгеймера может служить ещё одно исследование, в котором лабораторным мышам с повышенным амилоидогенезом и обычным мышам хирургически объединили кровоток. В результате здоровые мыши начали накапливать Аβ в мозге, что вообще не характерно для этих грызунов.

      Это исследование впервые показало потенциальную возможность проникновения Аβ с кровью в мозг и последующее участие в развитии нейродегенерации [10].
      Взаимосвязь накопления в тканях β-амилоида и τ-белка с возрастными нейропатологиями определяет необходимость поиска эффективных методов по выявлению этих белковых агрегатов как биомаркеров будущей нейропатологии и ускоренного старения. Сегодня уже известно несколько таких методов. Например, отложения амилоидов в тканях головного мозга можно детектировать с помощью позитронно-эмиссионной томографии, когда β-амилоид определяют по радиоактивному изотопу, введённому в организм и соединившемуся с амилоидом.
      Рисунок 6
      Снимки разрезов головного мозга, сделанные с с помощью позитронно-эмиссионной томографии
      Одними из самых чувствительных биомаркеров в ранней диагностике болезни Альцгеймера и умеренных конгитивных нарушений (УКН) в переходной к патологии фазе сегодня считаются уровни амилоида Аβ-42, общего τ-белка и фосфорилированного τ-белка в спинномозговой жидкости (ликворе). Причём амилоиды при патологии показывают уменьшения уровня, а уровни в ликворе τ-белка, общего и фосфорилированного — увеличиваются. Связано это с тем, что у здоровых людей нет скоплений амилоида в виде бляшек и большое количество свободного амилоида обнаруживается в ликворе. Низкие же значения τ-белка показывают отсутствие разрушения нейронального цитоскелета.

      Обнаружена значительная корреляция между возрастом и замедлением выведения β-амилоида из нервной системы, что может быть связано со склерозированием лимфатических сосудов и снижением их дренажных способностей. Восстановление дренажа — один из перспективных методов лечения болезни Альцгеймера, предложен компанией Leucadia, интервью с основателем которой было переведено и опубликовано на habr.com/post/371513.
      Так, нормальными показателями для здорового человека может считаться концентрация в ликворе Аβ-42 на уровне 716,9±94,2 нг/мл. А уровень Аβ-42, показывающий повышенный риск развития нейропатологии, составляет <209 нг/мл. Для τ-белка нормальными показателями в цереброспинальной жидкости считаются уровни 73,9±51,7 нг/мл. Повышение уровней τ-белка до 231,6±158,5 нг/мл уже может свидетельствовать о наличии активного нейродегенеративного процесса. По сегодняшним представлениям, комбинированное изучение уровней в ликворе Аβ-42 и τ-белка показывают высокую чувствительность в ранней диагностике нейропатологий — 94% вероятности диагностики болезни Альцгеймера [11].

      В скором времени ожидается появление ультрачувствительных иммунологических и масс-спектрометрических методов диагностики амилоидоза (соотношения Aβ42/40 или APP669-711/Aβ42 протеинов) и нейродегенерации (τ-белки и нейрофиламенты) в плазме крови [12]. Также существуют «безметочные» методы обнаружения неправильно свернутых протеинов в плазме [13].
      Часть 2
      SENS-Диагностика. Биомаркеры внутриклеточного «мусора»
      Продолжение серии научных обзоров SENS-диагностики. В этот раз внимание уделено биомаркерам внеклеточного "мусора".
      Часть 4
      SENS-Диагностика. Биомаркеры гликирования белков
      Продолжение серии научных обзоров SENS-диагностики. В этот раз внимание уделено биомаркерам гликирования белков.
      Присоединяйтесь к обсуждению
      Telegram